RIASSUNTO

E’ stata scoperta una nuova metodica di laboratorio che permette di preparare da una quantità di sangue conteuta (40ml), un concentrato piastrinico che viene attivato per ottenere un gel e delle membrane piastriniche, la cui applicazione all’interno della ferita determina un incremento in situ della concentrazione dei fattori di crescita tessutale che sono in grado di favorire, accelerandoli, i processi di guarigione e di rigenerazione dei tessuti circostanti.

Questa nuova procedura di laboratorio non è un’invenzione scientifica e non porta alla produzione di un prodotto utilizzabile a scopo terapeutico, ma rappresenta un’evoluzione rispetto alle tecnic
he del gel piastrinico, innanzitutto perchè la sostituzione della trombina bovina con la batroxabina offre una maggiore sicurezza in termini biologici, inoltre la possibilità di prelevare poco sangue rappresenta un vantaggio in termini pratici e, comporta un enorme beneficio per il paziente perchè, psicologicamente, provoca minor disagio.

TESTO SCIENTIFICO

Il  gel piastrinico, ricchissimo di fattori di crescita (GFs), si è rivelato particolarmente utile sia nel favorire i normali processi di guarigione dei tessuti sia nell’accelerare le fasi di rigenerazione ossea, offrendo ai clinici la possibilità di poter disporre di uno strumento per incrementare sia la qualità sia la quantità finale di osso neoformato.

 

La possibitità di poter modellare il gel piastrinico consente, inoltre, una sua più ampia applicazione clinica. Studi recenti hanno permesso di riscontrare che, grazie ai recupero e all’attivazione del plasma povero di piastrine (PPP), finora non utilizzato nei protocolli classici di preparazione del concentrato piastrinico (CP), è possibile ottenere, in combinazione con l’impiego del CP attivato, una maggiore quantità di questo materiale biologico. Conseguentemente, l’opportunita di poter utilizzare entrambi gli emocomponenti (CP e PPP} permette, da un lato, di effettuare un prelievo sempre più contenuto di sangue intero riducendo ancora di più la morbilità del paziente, dall’altro, di utitizzare tutte le piastrine presenti nel sangue processato e, verosimilmente, poter disporre di una maggiore quantità di GFs. il presente lavoro descrive le modifiche apportate alla metodica, riuscendo infine a modellare il gel attivato a membrane e utilizzando anche quella frazione di plasma meno arricchita di piastrine, ma ugualmente utile nell’incrementare il processo di rigenerazione. La messa a punto di una metodologia che permetta di ottenere un gel piastrinico molto malleabile e di facile applicazione in chirurgia orale, clinicamente efficace per varie applicazioni (siti estrattivi, rialzi di seno, difetti parodontali) nonchè in interventi di chirurgia maxillofacciale, è senza dubbio una delle innovazioni più affascinanti e interessanti di questi ultimi anni. In effetti, la possibilità di poter utilizzare un concentrato piastrinico (PRP/CP) che, una volta attivato, appare particolarmente utile nel f`avorire i processi di guarigione e nell’accelerare le fasi di rigenerazione ossea, sta riscontrando sempre maggiori favori. Considerando le basi biologiche e cellulari, l’innesto osseo può essere suddiviso in tre componenti Fondamentali (figura 1): . le cellule osteoprogenitrici (fibroblasti, osteoblasti, condrociti) che sono in grado di produrre osso; . una matrice osteoconduttiva che rappresenta l’impalcatura che deve sostenere l`innesto durante il processo di guarigione; svolge, quindi, questo ruolo di osteoconduzione, anche perché è la struttura attraverso la quale si formano i nuovi vasi; . i fattori di crescita (GFS) osteoinduttivi (PDGF,TGF-b, IGF-I E II) e le proteine morfogenetiche (BMPs) che sembrano svolgere un ruolo critico nella guarigione dell’osso. Dati di letteratura hanno dimostrato che le BMPs sono peptidi osteoinduttivi, appartenenti alla superfamiglia del TGF-B, e svolgono una funzione pleiomorfica che va dall’organogenesi extracellulare e scheletrica alla generazione dell’osso e alla rigenerazione. Nel caso specifico della chirurgia implantare, le BMPs sembrano in grado di stimolare la formazione di nuovo osso nel sito dell’impianto. Di contro.i GFs polipeptidici sono mediatori biologici naturali che regolano gli eventi cellulari cruciali coinvolti nella riparazione dei tessuti, come la sintesi del DNA, la chemiotassi, la differenziazione e la sintesi della matrice. Esempi di GFs individuati localmente nell`osso, nel cemento e nel tessuto di rigenerazione, includono il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGP), il fattore di crescita trastormante B (TGP-B), il fattore di crescita dei fibroblasti acido (aFGF) e basico (bFGF),i fattori di crescita tipo insulina (IGF-I e IGF-ll) e il Fattore di crescita derivato dal cemento (CCP). L’espressione di vari GFs, citochine e chemochine come conseguenza di danno tissutale, è in grado di regolare il processo di guarigione e di rigenerazione ossea, che comporta una complessa interazione di molti fattori biologici locali e sistemici. Questa complessa interazione di mediatori locali, risultato di meccanismi autocrini e paracrini, stimola le cellule mesechimali indifferenziate a migrare, proliferare e differenziare in sede di innesto. Lo studio delle complesse interazioni tra molteplici GFS sul metabolismo osseo si è dimostrato molto importante per diverse ragioni: . numerosi GFs (IGF-l, TGF—B, bFGF e PDGF) vengono sequestrati nella matrice ossea ad alte concentrazioni; . le cellule dell`osso rilasciano numerosi GFs; . si verifica, durante la riparazione dell’osso (come nella guarigione delle fratture), un’espressione temporanea di geni che codificano sia per GFs multipli che per i loro corrispondenti prodotti genici multipli. Ai Fini dei processi di guarigione e della rigenerazione ossea, l`attenzione deve essere rivolta ai granuli piastrinici Alfa che contengono, oltre a proteine plasmatiche e fattori della coagulazione, tutti quei GFS che si ritengono mediatori della guarigione e della rigenerazione, È stato, infatti, dimostrato che la fase iniziale della rigenerazione sia caratterizzata dal rilascio, in sede di innesto. di PDGF,TGF-B e IGF-I e II, mediante degranulazione delle piastrine. ll PDGF, da un lato, stimola la proliferazione delle cellule staminali midollari presenti nell`innesto osseo, cosi da aumentare il loro numero di diversi ordini di grandezza, dall’altro, grazie alla sua azione angiogenetica, determina la formazione di nuovi capillari nell’innesto. Nello stesso tempo. il TGF-B. che è mitogeno per i fibroblasti e per i preosteoblasti, aumenta specificamente il numero di queste cellule. Successivainente, il TGF-B promuove la differenziazione dei preosteoblasti verso forme più mature. La secrezione continua di TGF-B influenza, da un lato, gli osteoblasti a rilasciare matrice ossea, dall`altro,i fibroblasti a depositare matrice di colllagene necessaria a sostenere la crescita dei capillari. L’IGF-I e ll agiscono sugli osteoblasti dell`endostio, che possono così iniziare a colmare le trabecole dell’osso spugnoso innestato. In tabella 1 vengono riassunte le funzioni principali dei fattori di crescita che si ritengono coinvolti nei processi di guarigione e di rigenerazione ossea. Al momento, questa nuova. metodologia del gel piastrinico, che permette di combinare il gel piastrinico sia con osso autogeno spugnoso e corticale (figura 2) sia con matrice ossea esogena (figura 3), offre la possibilità di usufruire dell’impiego dei GFs e delle BMPS. La necessità di rigenerare è talvolta richiesta per trattare perdite ossee dovute a traumi, tumori, osteonecrosi o condizioni congenite, Gli innesti ossei autogeni sono considerati i “gold standards” per il materiale di innesto ma, talvolta, ci si trova ad affrontare il problema di poter disporre soltanto di una quantità limitata di osso disponibile per la raccolta dal paziente e, conseguentemente, nascono problemi legati alla morbilità del sito donatore. Queste limitazioni hanno suscitato un interesse crescente nell`impiego di innesti ossei alternativi, come gli alloplastici. Dal momento che è stato dimostrato che GFs e BMPs, il cui potenziale osteoinduttivo è stato valutato in svariati modelli sia in vivo sia in vitro e sono essenziali per la fisiologia del processo di riparazione dell`osso,è naturale considerarli come potenziali agenti osteoinduttivi. ll gruppo di Marx, pioniere in questo campo, ha elaborato una procedura che prevede la raccolta di plasma autologo ricco di piastrine, indispensabile per formare il gel. Le piastrine vengono isolate e concentrate a partire dal sangue del paziente (prelievo di 450-500 ml) permettendo, quando si degranulano per l’aggiunta di trombina bovina e calcio cloruro, di ottenere GFs, citochine, fibrina e molecole di adesione. L’importanza dell’utilizzo del gel piastrinico nella pratica chirurgica, e in altre discipline della medicina (trattamento di ulcere croniche, da decubito, ustioni], ha indotto il nostro gruppo di studio a mettere a punto una metodologia efficace, affidabile, semplice, economica e che permette di ottenere rapidamente in laboratorio un gel piastrinico autologo così da poter essere utilizzato di routine nella chirurgia orale, implantare, parodontale e maxillofacciale. Al momento, questo protocollo permette di preparare, in modo riproducibile e standardizzabile, un concentrato piastrinico a partire da un prelievo di 60 ml di sangue venoso che viene attivato mediante una miscela di calcio gluconato e botropase, per ottenere un gel di piastrine, la cui applicazione verosimilmente determina localmente un incremento della concentrazione dei GFs tissutali tale da accelerare la guarigione e la rigenerazione dei tessuti circostanti. Si ritiene che le innovazioni fondamentali di questa tecnica, rispetto a quella di Marx et al., consistano: . nella possibilità di poter prelevare poco sangue, rispetto al prelievo di 500 ml di sangue venoso necessario per realizzare la procedura di Marx et al,, che rappresenta senza dubbio un vantaggio in termini pratici e comporta una scarsa rnorbilità per il paziente; . nella rapidità, facilità di esecuzione e costo veramente minimo che consentono di rendere routinaria la procedura di prepararazione del gel piastrinico; . nella sostituzione della trombina bovina con il botropase, aspetto di fondamentale importanza poiché si rende possibile la fattibilità e l’applicazione di questo protocollo in Italia, dal momento che finora l’attivazione del concentrato piastrinico poteva essere effettuata solo ed esclusivamente mediante la trombina di natura bovina, non commerciabile nel nostro Paese; inoltre, l`uso del botropase è sicuramente da preferirsi alla trombina bovina dal momento che può offrire una maggiore sicurezza biologica. In questi ultimi mesi, sono state effettuate alcune modificazioni al protocollo di attivazione del concentrato piastrinico (CP), innanzitutto, il calcio cloruro è stato sostituito con il calcio gluconato dal momento che quest’ultimo sembra accelerare ulteriormente i tempi di gelificazione del CP Inoltre, l’esperienza maturata in questi mesi ha dimostrato che è suffìciente una quantità sempre più ridotta di botropase (200-300 ml) per attivare circa 6-7 ml di CP. lnfine, studi recenti, volti a perfezionare la metodica di preparazione e di attivazione del CP hanno permesso di giungere a evidenze molto interessanti, lnnanzitutto,e stato osservato che il gel piastrinico È un biomateriale modellabile: può prendere, infatti, la forma del recipiente in cui viene attivato; inoltre, l’impiego di botropase, in grado di provocare un’attivazione delle piastrine più lenta (5-10 minuti) rispetto alla trombina bovina (qualche secondo) permette di modulare la consistenza e le dimensioni del gel. Ovviamente, forma e consistenza sono in funzione della quantità di CP che si deve attivare e della forma del recipiente impiegato. La possibilità di poter plasmare il gel piastrinico e l’utilizzo di capsule Petri quale recipiente in cui eseguire l’attivazione del CP hanno consentito di ottenere un gel a Forma di membrana, del tutto simile a quelle usate in campo odontoiatrico. L’opportunità di disporre di una membrana di piastrine, quale tappeto ricco di GFs autologhi, che si può agevolmente maneggiare e che per la sua consistenza si può addirittura suturare (Figura 4), consente una più ampia applicazione clinica del gel piastrinico, offrendo anche prospettive inedite nella terapia rigenerativa che, attualmente, trova grande riscontro in chirurgia implantare e parodontale. Inoltre, è stato dimostrato che, grazie al recupero e all`attivazione del plasma povero di piastrine (PPP), finora non utilizzato nei protocolli classici di preparazione del CP in quanto considerato un prodotto di scarto per la sua povertà in piastrine, è di contro possibile ottenere ugualmente la formazione del gel. Una possibile spiegazione di questo risultato consiste nell’osservazione che, con la metodica di preparazione del CP messa a punto nel nostro laboratorio, sono ancora presenti nel PPP piastrine in una concentrazione tale da portare alla Formazione del gel, conseguentemente, l`opportunita di poter utilizzare sia il CP sia il PPP per ottenere il gel permette. da un lato. di effettuare un prelievo ancora più contenuto di sangue intero. riducendo, pertanto, sempre di più la morbilità del paziente. dall’altro di utilizzare, verosimilmente. tutte le piastrine presenti nel sangue processato e. quindi, poter disporre di una maggiore quantità di GFs.

MATERIALI E METODI

Vengono prelevati 6O ml di sangue venoso in 12 ml di acido citrico-destrosio (ACD, BYK Gulden Italia SpA, Cormano, Milano) e processati secondo le procedure di routine. Dopo la preparazione, CP e PPP vengono tenuti a temperatura ambiente per almeno 15 rninuti prima di dare inizio alle fasi necessarie per ottenere il gel piastrinico. Il numero di piastrine viene determinato mediante un contaglobuli automatico (Advia 120, Bayer, Milano Italia). Sono stati allestiti citocentrifugati di CP, PRP e PPP, colorati con May Grunwvald/Giemsa per l’anaIisi morfologica. TECNICHE PER LA PREPARAZIONE DI CP E DI PPP Il sangue intero, raccolto in provette sterili (Falcon, Sacco, Milano) da 15 ml cadauna (n = 4), viene centrifugato a 180 giri al minuto per 20 minuti. II PRR, corrispondente alla fase chiara superiore, viene quindi trasferito in una nuova provetta e ulteriormente concentrato, mediante centrifugazione (580 giri al minuto per 15 minuti]. Il volume finale di 7 ml di CP è il risultato della risospensione del pellet piastrinico, ottenuto al termine della seconda centrifugata, in 5 ml di PPP (figura 5). ll PPP rappresenta Ia parte liquida soprastante il pellet che, invece di essere eliminato come previsto nei protocolli standard di preparazione del CP, viene raccolto in una provetta da 50 ml, pronto per essere attivato,
PROTOCOLLO DI ATTIVAZIONE

Preparazione del gel piastrinico da CP Il CP viene trasferito dalla provetta in un dappen sterile e può essere attivato da solo o in combinazione con osso autogeno e/o matrice ossea di sintesi. Un millilitro di miscela calcio gluconato/batroxobina, aspirato in una siringa da 2,5 ml e gentilmente agitato, viene aggiunto al CP contenuto nel dappen. Nell’arco di 3-5 minuti, il miscuglio di CP e miscela calcio gluconato/batroxohina assume una consistenza gelatinosa, dal momento che la batroxobina, principio attivo del botropase ed equivalente all’attività coagulante di 1+/- 2 unità trombiniche internazionali, è responsabile della polimerizzazione della fibrina in un gel insolubile, inducendo la degranulazione delle piastrine con conseguente rilascio di fattori di crescita e citochine. Il tempo di processamento richiesto per la separazione del sangue autologo nei suoi componenti (CP e PPP), secondo questa metodica, è di soli 45 minuti. Preparazione del Gel Piastrinico da PPP Il PPP, conservato nella provetta da 50 ml a temperatura ambiente, viene attivato dopo la preparazione del gel piastrinico ottenuto dal CP Le fasi principali consistono in: . raccolta, in provetta sterile, del liquido in eccesso, trasudato dal gel piastrinico e formatosi nel dappen al termine dell’attivazione; . aggiunta al PPP di calcio gluconato (10% del volume totale di PPP), quale antagonista dell`anticoagulante utilizzato per il prelievo; . travaso del suddetto liquido nella provetta contenente il PPP, con sua rapida trasformazione (da 30 secondi a 2 minuti) in una massa gelatinosa. Allestimento di membrane a partire dal CP attivato Il CP, attivato come descritto, mostra un’elevata plasmabilità che consente all`operatore di modellarlo a seconda delle esigenze cliniche, così che assuma la forma del recipiente in cui viene effettuata la sua attivazione. Attivando il CP in una capsula Petri (diametro di 35 o 60 mm a seconda delle dimensioni del gel piastrinico necessario per la rigenerazione ossea e/o la guarigione tissutale), è possibile dare al gel la forma di una membrana, la cui consistenza è proporzionale alla quantità del materiale attivato e alla dimensione della capsula stessa. Allestimento di membrane a partire dal PPP attivato Anche il PPP, il cui volume finale non è mai inferiore a 25 ml partendo da un prelievo venoso di 60 ml, può essere attivato e modellato a membrana, quando viene trasferito in una capsula Petri di dimensioni maggiori (diametro di 100 mm), dal momento che dimensioni inferiori della capsula non sarebbero in grado di contenere tutto il PPP a disposizione. Analisi istopatologica Le biopsie ossee sono state fissate in formalina tamponata al 10%, demineralizzate in acido formico al 5% per 48 ore, decalcificate in acido nitrico e incluse in cera di paraffina. Da ogni biopsia sono state ricavate sezioni spesse 5um, colorate con ematossilina-eosina, osservate e fotografate al microscopio ottico (Nikon). Sono stati allestiti vetrini, esaminati con un analizzatore di immagine, per effettuare una valutazione istomorfometrica.
RISULTATI

Dalle conte piastriniche basali del CP e del PPP eseguite su 15 pazienti (tabella 2) mediante sistema ematologico automatico, si evince che il gel ottenuto da CP presenta una concentrazione piastrinica incrementata in media di 4 volte rispetto al sangue intero (CP/basale = 400%), mentre quello derivante dall’ impiego di PPP risulta essere depauperato soltanto del 30% delle piastrine totali (PPP/basale = 70%). In figura 5 vengono riportate le densità piastriniche che sono state riscontrate all’osservazione al microscopio ottico dopo colorazione May Grunwald/Giemsa, relative a strisci di sangue periferico intero e citocentrifugati allestiti a partire da CP e PPP dello stesso paziente. Nel PPP si può osservare, come comprovato dalle conte sopra citate, un modesto incremento della concentrazione piastrinica rispetto a quanto osservato nello striscio di sangue periferico intero; sufficiente, tuttavia, per la preparazione di un gel da modellare a seconda delle necessità cliniche. Il calcio gluconato e il botropase, quando aggiunti al CP attivano le piastrine in esso contenute e iniziano il processo di coagulazione, caratterizzato dalla conversione del fibrinogeno in fibrina (Figura 6) che risulta nella formazione di un ge] clinicamente utile per migliorare la manipolazione e l’efficacia di particolari innesti di osso autologo o di sostituti. L’analisi istologica delle biopsie ossee, effettuate a distanza di 5 mesi dalla chirurgia (figura 7), e gli studi istomorfometrici eseguiti sui vetrini allestiti a partire dalle suddette biopsie (figure 8-10), sembrano evidenziare che, quando viene impiegata una miscela di innesto osso autologo-gel piastrinico (figura 2) e/o matrice ossea di sintesi-gel piastrinico (tigura 3), si osserva, da un lato, un aumento del tasso di velocità di formazione dell’osso e, dall`altro, un incremento della densità ossea. Quando l’attivazione del gel piastrinico viene effettuata in capsule Petri, e possibile plasmarlo a membrana (figura 11). A gelificazione avvenuta, la membrana può essere scollata dalle pareti della capsula (figura 12), in modo da poter recuperar il liquido in eccesso da essa trasudato (figura 13), che viene immediatamente utilizzato per l’attivazione del PPP, raccolto in un`altra capsula Petri di dimensioni maggiori (figura 14),
DISCUSSIONE E CONCLUSIONI

I meccanismi e il potenziale di formazione e riparazione ossea sono stati delucidati rapidamente durante gli ultimi dieci anni. Nonostante rimangano aperte ancora molte problematiche, è·per ora chiaro che numerose citochine e GFs; polipeptidici giocano un ruolo essenziale in questi processi così complessi. E ormai universalmente riconosciuto che GFs e BMPs, (attori trascrizionali che regolano la proliferazione e la differenziazione delle cellule mesenchimali,svolgono un ruolo di primaria importanza nel rimodellamento, nella rigenerazione e nelle fasi di guarigione sia dei tessuti molli sia di quelli duri. Il gel piastrinico,rivelandosi un bioproclotto ricchissimo di GFS, favorisce, accelerandoli, i normali processi sia di guarigione sia di rigenerazione tissutali. I recenti risultati ottenuti da diverse sperimentazioni cliniche hanno indotto a credere che l’impiego di un solo GF non sia sufficiente per risolvere tutti i problemi connessi ai processi di riparazione ma, al contrario, si ritiene che una rete complessa di GFs, citochine e altri mediatori biologici debbano essere usati più specificamente per ottenere una guarigione completa delle ferite e una rigenerazione rapida ed efficace. In questo articolo vengono riportati i correnti progressi nella preparazione del gel piastrinico. Come riportato in letteratura questo biomateriale, usato in svariate applicazioni con apparente successo clinico, è una modificazione autologa della colla di fibrina. Da circa un anno, nel nostro laboratorio, è stato messo a punto un protocollo riproducibile e standardizzato, che permette di preparare rapidamente e con un costo contenuto il gel piastrinico che, al momento, viene usato in combinazione con procedure chirurgiche ablative della regione maxillofacciale, per ricostruzioni mandibolari e in aggiunta a procedure finalizzate ai posizionamento di impianti osteointegrati. Recentemente, abbiamo adottato una procedura che prevede la preparazione di membrane di piastrine, ottenute modellando il gel formatosi, attivandolo con una miscela calcio gluconato/botropase sia CP sia PPP. Ovviamente, la possibilità di poter plasmare il gel piastrinico, consentendo una sua più ampia applicazione clinica, è da considerarsi assolutamente positiva. È, tuttavia, importante tenere presente che la somiglianza delle membrane di piastrine con quelle del commercio si ferma però solo alla forma, dal momento che le classiche membrane tanto in uso in chirurgia orale producono il famosissimo “effetto barriera”, mentre le membrane di piastrine non sono altro che un tappeto di GFs autologhi. Ora, l’opportunità di disporre di un tessuto ricco di tali fattori, che si può agevolmente maneggiare e per la sua consistenza addirittura suturare, apre prospettive inedite nella terapia rigenerativa, che attualmente trova grande riscontro in odontoiatria. Inoltre, l’opportunità di poter utilizzare sia CP sia PPP permette, da un lato, di effettuare un prelievo sempre più contenuto di sangue intero, riducendo ancora di più la morbilità del paziente, dall’altro, di utilizzare tutte le piastrine presenti nel sangue processato e, verosimilmente, poter disporre di una maggiore quantità di GFs. Pertanto, questi studi sono stati finalizzati ad apportare delle evoluzioni alla tecnologia di preparazione del gel piastrinico, riuscendo a modellare a rnembrane questo gel attivato e a utilizzare anche quella frazione di plasma meno arricchita di piastrine, ma ugualmente utile nell’incrementare il processo di rigenerazione. Inoltre, si rende noto che risultati sperimentali alquanto promettenti, ottenuti anche nel trattamento delle ulcere diabetiche e vascolari, rnediante l`impiego del gel piastrinico modellato a membrane con la tecnica da noi messa a punto, non possono che incoraggiarci ad approfondire questo studio. È, pertanto, possibile che le evoluzioni della tecnica del gel piastrinico possano essere applicate con successo anche ad altre discipline della medicina. Considerando i risultati incoraggianti raggiunti finora, nasce inevitabilmente l’esigenza di comprendere il meccanismo fisiologico alla base del potenziale di guarigione e di rigenerazione, proprio del gel di piastrine.